一种蜂花粉中农药残留的检测方法与流程（专利）

一种蜂花粉中农药残留的检测方法与流程（专利）

    本发明涉及液相色谱检测技术领域，具体涉及蜂花粉中常见农药残留的检测。
   背景技术：
   目前，关于蜂花粉中多种农药残留的分析方法较少，报道的方法是大部分用来检测新烟碱农药残留。但是由于蜜蜂蜂箱暴露在多残留的作物周围，并且蜂巢内也会使用其他农药如杀螨剂和杀菌剂以减少螨类和微孢子虫的危害。数据表明蜂巢内存在不同浓度水平的杀虫剂、杀菌剂和除草剂残留。因此，有必要开发一种简单、灵敏的常用农药残留分析方法。
   由于蜂花粉中丰富的脂类(10-20％)和蛋白质(30-40％)会干扰残留分析的测定，因此，若想准确地测定蜂花粉中的农药残留，寻找一种能够高效除去蜂花粉中内在干扰物(脂类和蛋白质)的前处理方法是前提，确定恰当的色谱检测条件是成功检测的关键。

    技术实现要素：
    本发明的目的是提供一种蜂花粉中农药残留的检测方法，在对待测蜂花粉进行检测前，对其进行如下预处理：
    1)用乙腈充分提取待测蜂花粉中的农药残留，得溶解有农药残留的乙腈溶液；
    2)将所述溶解有农药残留的乙腈溶液在-75～-80℃条件下放置3～8min，去除其中的脂类物质；
    3)通过净化柱对去除脂类物质的乙腈溶液进行净化，得待测样。
    现有技术中也有采用乙腈对蜂花粉中的农药残留进行提取的技术方案，但是通常仅能提取一种或两种农药残留，采用上述的预处理方法，可将蜂花粉中的9种常见农药残留多菌灵、噻虫嗪、噻虫胺、吡虫啉、啶虫脒、三唑醇、嘧菌酯、蝇毒磷和毒死蜱同时进行充分地提取，农药残留的损失较小，且提取液中脂类和蛋白质类的干扰性杂质少，为准确地检测9种常见农药残留奠定基础。
    优选的，所述步骤1)具体为：先将所述蜂花粉溶解于水中，得蜂花粉的水溶液，然后在所述蜂花粉的水溶液中添加乙腈，进行充分提取后得溶解有农药残留的乙腈溶液；
    进一步优选的，包括如下步骤：
    A、将待测蜂花粉与水按质量体积比1:2～3混合后充分搅拌，使蜂花粉充分溶解于水中，得蜂花粉的水溶液；
   B、按待测蜂花粉与乙腈的质量体积比1:2.5～10，将乙腈添加到所述蜂花粉的水溶液中，得混合溶液，对所述混合溶液进行超声处理，然后进行分层处理，取乙腈层，即得溶解有农药残留的乙腈溶液。
优选的，所述步骤2)中的冷冻条件为在-80℃的条件下冷冻3～5min。
   优选的，所述净化剂为PSA、C18、GCB或Cleanert NANO CARB(m-PFC)。
   进一步优选Cleanert NANO CARB。通过净化柱的净化处理，可对提取液中的杂质进行有效去除。
优选的，所述待测蜂花粉与乙腈的质量体积比为1:6～8。在上述用量比的情况下可实现充分的提取且不会带来乙腈的浪费。
    优选的，所述超声处理的条件为在功率为100W的超声条件下处理15～25min。在上述条件下进行超声处理，可对待测花粉中的农药残留进行充分提取，显著提高溶剂的提取效率。
优选的，超声处理完成后向所述混合溶液中加盐使其分层。
    进一步优选的，所述盐为氯化钠或硫酸镁。通过添加盐类进行分层可除去待测液中的水分或使水相和乙腈有机相完全分离，保证目标农药化合物完全浸提到乙腈有机相中，继而显著提高农药的回收率。
进一步优选的，在操作的过程中，将样品通过净化柱净化2次。
    作为优选的方案，所述样品的预处理包括如下步骤：
    1)将待测蜂花粉与水按质量体积比1:2～3混合后充分搅拌使蜂花粉充分溶解于水中，得蜂花粉的水溶液；按待测蜂花粉与乙腈的质量体积比1:6～8，将乙腈添加到所述蜂花粉的水溶液中，得混合溶液，对所述混合溶液在功率为100W的超声条件下处理15～25min，加氯化钠或硫酸镁使混合液分层，取溶解有农药残留的乙腈层；
    2)将所述溶解有农药残留的乙腈层在-80℃条件下放置4min，去除其中的脂类物质；
    3)用净化柱Cleanert NANO CARB对去除脂类物质的乙腈溶液净化2次，得待测样。
    优选的，通过液相色谱法对待测蜂花粉进行检测的步骤如下：
    1)对待测蜂花粉进行预处理，得所述待测样；
    2)通过液相色谱对所述待测样进行检测，选择体积分数为0.1％的甲酸的水溶液为流动相A，体积分数为0.1％的甲酸的乙腈溶液为流动相B，对待测蜂花粉进行梯度洗脱；
梯度洗脱的过程中，0～3min，流动相B的体积分数由30％增加到50％；3-5min，流动相B的体积分数由50％增加到75％；5-6min，流动相B的体积分数由75％增加到90％；6-11min，流动相B的体积分数维持在90％。
    在上述的检测条件下，可对提取得到的9种常见的农药，多菌灵、噻虫嗪、噻虫胺、吡虫啉、啶虫脒、三唑醇、嘧菌酯、蝇毒磷和毒死蜱进行理想得分离和检测。
    优选的，流动相的流速为0.3～0.4mL/min；
    优选的，检测器为三重四级杆质谱检测器。
    进一步优选的，质谱检测的条件为气体温度340℃，气体流速12L/min，喷雾器电压:40psi，毛细管电压:4000V，喷雾室电流:1.1μA，电子倍增管电压:400，通过质谱检测可有效提高仪器检测的灵敏度和目标监测离子的响应值。
    本发明的方法具有如下有益效果：
    1)本发明通过对蜂花粉中农药残留提取方法的优化，可充分地提取蜂花粉中常见的9种农药残留，为后续的准确检测奠定基础。
    2)本发明通过对液相色谱检测条件和质谱检测条件的优化，可对蜂花粉中常见的农药残留进行理想得分离，实现准确地检测。
    附图说明
    图1提取溶剂体积对9种农药回收率的影响；
    图2冷冻时间对9种农药回收率的影响；
    图3净化剂类型对9种农药回收率的影响；
    图4净化柱Cleanert NANO CARB过滤次数对9种农药回收率的影响。
    具体实施方式
    以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
    实施例1
    本实施例涉及蜂花粉中农药残留的检测，包括如下步骤：
A、样品的前处理
1)称取2g待测花粉置于50mL离心管中，向离心管中加入5mL纯水，涡旋1min，得蜂花粉的水溶液；
2)向所述蜂花粉的水溶液中加入15mL乙腈，在功率100W的超声下提取20min，向50mL离心管中加入盐包(氯化钠或硫酸镁)，涡旋震荡1min，取乙腈层；
3)将所述乙腈层在-80℃条件下放置4min，3800rpm，4℃离心5min，取上清液。
4)将所述上清液过Cleanert NANO CARB小柱，共推2次，完成样品的前处理。
B、色谱分析
对前处理完成的样品进行LC-QQQ-MS/MS分析。
液相色谱分析的条件为：进样量0.5μL；
流动相流速：0.350mL/min；
流动相：A、体积分数0.1％甲酸水B、体积分数0.1％甲酸的乙腈；
梯度洗脱的程序为：0～3min，流动相B的体积分数由30％增加到50％；3-5min，流动相B的体积分数由50％增加到75％；5-6min，流动相B的体积分数由75％增加到90％；6-11min，流动相B的体积分数维持在90％。
质谱条件为：气体温度:340℃、气体流速:12L/min、喷雾器压力:40psi、毛细管电压:4000V、喷雾室电流1.1μA、电子倍增管电压:400。各化合物的质谱采集参数见表1。
C、线性方程、检出限和定量限
取各种农药成分的标准品，配置成浓度为100mg L-1的储备液。乙腈/基质溶液稀释，将其分别配制成浓度为0.01、0.05、0.1、0.5、1、2.5、5mg L-1 7个不同水平的混合标准溶液，经HPLC-QQQ测定后，以质量浓度为横坐标，峰面积为纵坐标建立标准曲线。以添加回收样品峰响应值为3倍噪音的添加浓度计算方法检出限(LOD),以10倍噪音的添加浓度计算方法定量限(LOQ)。
结果如表2所示，在0.01-5mg L-1浓度范围内线性良好，相关系数范围为0.9922-0.9996，机制效应范围为0-29.29％。多菌灵的检出限和定量限分别为0.60和2.03μg/kg，噻虫嗪、噻虫胺、吡虫啉、啶虫脒、三唑醇和嘧菌酯的检出限和定量限分别为0.75和2.63μg/kg，蝇毒磷和毒死蜱的检出限和定量限分别为45和150μg/kg。
表1 9种化合物的保留时间、监测离子和碰撞电压
表2 9种农药的检测线(LOD)、定量限(LOQ)、线性方程、相关系数(R2)以及基质效应(ME)
注：基质效应(％)＝(样品基质中添加的相同含量农药响应值)/(在纯溶剂中农药的响应值)×100
实验例
本实验例对本申请的方法的准确性进行了验证，在空白油菜花粉样品中添加150、375和750μg/kg 3个不同水平的混合标准溶液进行回收率实验，每个添加浓度平行重复5次，计算回收率和相对标准偏差(RSD)。结果如表3所示，在油菜花粉中9种农药的平均加标回收率在82.5％-112.9％之间，相对标准偏差(RSD)在1.6-10.8％之间，方法具有较好的回收率和重现性。
表3 9种农药的加样回收率(n＝5)和相对偏差(RSD)
对比例1
本对比例涉及提取剂体积的调整，与实施例1相比，其区别仅在于，样品前处理的步骤1)中，提取溶剂乙腈体积优化：5mL、10mL、和20mL，并与实施例1中的15mL进行对比，其结果见图1。由图1可知，当提取剂的体积为15mL时，提取得到的待测物含量最高。
对比例2
本对比例涉及提取过程中冷冻时间的调整，与实施例1相比，其区别在于，样品前处理的步骤3)中，将冷冻时间分别调整为0min和8min，与实施例1相中冷冻4min进行比较，其结果见图2，由图2可知，冷冻时间为4min时，提取得到的待测物含量最高。
对比例3
本对比例涉及提取过程中多壁碳纳米管滤过型净化柱的调整，与实施例1相比，其区别在于，前处理的步骤4)中，净化剂类型分别选：PSA、C18、GCB和实施例1中的净化柱Cleanert NANO CARB(m-PFC)进行比较，其结果见图3，由图3可知，Cleanert NANO CARB(m-PFC)净化柱的提取效果最好。
对比例4
    本对比例涉及Cleanert NANO CARB固相萃取柱次数的调整，与实施例1相比，其区别仅在于，上清液过Cleanert NANO CARB固相萃取柱的次数分别为1次和3次，并与实施例1中过2次的操作进行比较，其结果见图4。图4可知，过柱2次时，提取得到的待测物含量最高。
    虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。